badanie testosteronu kraków

Dodatkowo, specyficzny inhibitor ICE i myszy ICE KO zastosowano do oceny roli tego enzymu w produkcji i uwalnianiu dojrzałej bioaktywnej IL-18 w odpowiedzi na IL-12. Na koniec, mierzyliśmy poziomy IL-18 zarówno in vitro, jak i in vivo w obecności lub nieobecności stymulacji IL-12. Metody Odczynniki i myszy. Mysi rekombinant IL-12 był życzliwym darem Genetics Institute Inc. (Andover, Massachusetts, USA). Specyficzna aktywność IL-12 wynosiła 2,7 x 106 U / mg. Ludzki rekombinowany antagonista receptora IL-1 (IL-1Ra) był miłym darem Daniela Traceya (Upjohn Co., Kalamazoo, Michigan, USA). Odwracalny inhibitor ICE, Ac-Tyr-Val-Asp-2,6-dimetylobenzoiloksymetyloketon, zakupiono od Alexis Corp. (San Diego, Kalifornia, USA). RPMI i FBS pochodziły z Life Technologies Inc. (Grand Island, New York, USA). Anty-mysie przeciwciało CSF pochodziło od Endogen Inc. (Woburn, Massachusetts, USA). Pokolenie i genetyczne tło myszy ICE KO opisano wcześniej (22). Użyto samic myszy w wieku od 6 do 8 tygodni. Zastosowane myszy typu dzikiego (WT) miały takie same tło genetyczne, płeć i wiek, co myszy z ICE KO, chociaż nie były one młodymi miotami. Badania eksperymentalne in vivo. Badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystywania i Opieki nad Zwierzętami w Centrum Nauk Zdrowotnych Uniwersytetu Kolorado. Myszom wstrzykiwano dootrzewnowo 100 lub 400 ng mysiej rekombinowanej IL-12 dziennie przez 4 dni, między 09:00 a 1100 godzin. Grupy kontrolne otrzymywały 4 codzienne iniekcje nośnika (PBS [pH 7,4] zawierające 0,1% BSA). W niektórych doświadczeniach myszom wstrzyknięto 200 .l neutralizującej króliczej anty-mysiej IL-18 surowicy odpornościowej (13) godzinę przed pierwszym i trzecim wstrzyknięciem IL-12. Grupę myszy otrzymujących normalną surowicę króliczą (NRS) włączono jako kontrolę dla myszy otrzymujących antyserum anty-IL-18. Dwie godziny po czwartym wstrzyknięciu IL-12 pobrano krew ze splotu oczodołu pod znieczuleniem metoksyfluranem. Myszy uśmiercono przez przemieszczenie kręgów szyjnych, a śledziony i wątroby usunięto. Śledziony i wątroby ważono, homogenizowano w 4 objętościach lodowatego PBS zawierającego 0,2% Tween-20 i wirowano przez 5 minut przy 3000 g w mikrowirówce. Następnie zebrano supernatanty do pomiarów cytokin. Izolacja i kultura komórek śledziony. Śledziony usunięto aseptycznie, a zawiesiny komórkowe przygotowano zgodnie ze standardowymi procedurami (23). Komórki przemyto dwukrotnie RPMI, ponownie zawieszono w RPMI zawierającym 10% FBS i hodowano w 5 x 106 / ml na 24-studzienkowych płytkach. Hodowle inkubowano przez różne okresy w 37 ° C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Pod koniec okresu inkubacji zebrano supernatanty. Komórki ponownie zawieszono w pierwotnej objętości RPMI i lizowano przez dodanie 0,5% Triton X-100. Zarówno supernatanty, jak i lizaty komórkowe zamrożono w ~ 70 ° C, aż były gotowe do pomiaru cytokin. Pomiary cytokin. Zarówno IL-18, jak i TNF-a poziomy zmierzono przy użyciu metody elektrochemiluminescencji (ECL) (24). TNF-. test został wcześniej opisany (25). Do pomiaru IL-18 zastosowano podobną procedurę. Oczyszczone na powinowactwie przeciwciało poliklonalne królicze przeciw mysiemu IL-18 (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) zostało wyznakowane biotyną (IGEN Inc., Gaithersburg, Maryland, USA) i monoklonalną anty-mysią IL-18 przeciwciało (R & D Systems Inc.) znakowano chelatem rutenu (II) trisbipyridae (IGEN Inc.). Biotynylowane przeciwciało rozcieńczono do 0,5 .g / ml w PBS (pH 7,4) z 0,25% BSA, 0,5% Tween-20 i 0,01% azydkiem sodu (bufor ECL).
[patrz też: płyn w worku osierdziowym, trójglicerydy norma, zagorz pl ]