nowotwór nerki złośliwy

Analizy cytometrii przepływowej. Proporcje i liczby komórek NK w różnych populacjach oceniano za pomocą analizy cytometrii przepływowej po dwukolorowym barwieniu pod kątem obecności markera powierzchniowego komórek NK, NK1.1 i braku markerów powierzchni komórek T, CD3. lub TCR-y. Dla próbek śledziony i krwi, skoniugowany z R-fikoerytryną koniugowany anty-NK1.1 klonu PK136 i anty-CD3 skoniugowany z CyChrome. Stosowano klon mAb 145-2C11 (PharMingen). Aby lepiej odróżnić klasyczne komórki NK od populacji limfocytów T NK w wątrobie (27), skoniugowany z R-fikoerytryną koniugowany anty-NK1.1 klon klonu PK136 i skoniugowany z CyChrom anty-TCR-y. zastosowano łańcuch monoklonalny klonu H57-597 (PharMingen). Uwzględniono odpowiednie etapy blokowania. Kontrolne przeciwciała nie rozpoznające określonych determinant (PharMingen) zostały użyte do skorygowania fluorescencji tła i ustawiły bramki do analizy z ponad 97% komórek barwionych kontrolą w negatywnych populacjach. Co najmniej 20 000 zdarzeń uzyskano dla próbki przy użyciu FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California, USA) ze stałym strumieniem lasera argonowym 15 mW przy długości fali 488 nm. Dane zostały pozyskane i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Cellquest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Analizy cytokin. Próbki surowicy lub homogenaty śledziony i wątroby badano na obecność IFN-y. przez standardowy test kanapkowy ELISA (6. 9). Granice wykrywalności wynosiły 20 pg / mL dla próbek surowicy i 10 .g / mL dla homogenatów tkankowych. Zmiany kolorymetryczne po dodaniu substratu zostały wykryte zgodnie z opisem (26). Przygotowanie i analizy RNA. Całkowity wątrobowy RNA wytworzono przy użyciu UltraSpec (Biotecx Laboratory Inc., Friendswood, Texas, USA) i analizowano przez hybrydyzację Northern blot lub względną ilościową RT-PCR. Plazmidowy DNA, zawierający specyficzne sekwencje cDNA dla mysich Mig (17, 24) lub GAPDH, oznaczono jako [32P] dCTP przez losowe priming (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) do analizy Northern blot, co przeprowadzono zgodnie z opisem (24). ). W przypadku względnego ilościowego RT-PCR, próbki o całkowitej liczbie RNA 1. G poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA (2). Dla każdej próbki 5. L cDNA był matrycą do amplifikacji PCR przy użyciu IFN-a. lub startery specyficzne dla Mig. Jako wewnętrzne kontrole do przygotowania próbki, wprowadzania żelu i losowych zmian w RT-PCR, startery rRNA 18-S i kompetencje kompetycyjne 18-S rRNA (Ambion Inc.), stosowane do modyfikowania wydajności amplifikacji cDNA 18-S, włączono do każdej reakcji PCR. reakcja z docelowymi swoistymi dla genu starterami. Liniowy zakres amplifikacji i optymalny stosunek starter / starter 18-S / Competimer określono dla każdego genu docelowego zgodnie z zaleceniami producenta (Ambion Inc.). Amplifikacje przeprowadzono w programowalnym termocyklerze (PTC-100, MJ Research, Waltham, Massachusetts, USA) z wykorzystaniem parametrów rowerowych, jak opisano wcześniej (28). Startery oligonukleotydowe dla IFN-y otrzymano z CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA). Startery Mig zostały wybrane z opublikowanych danych sekwencji (29) i zostały zsyntetyzowane przez Operon (Alameda, Kalifornia, USA). Produkty rozdzielano na 1,8% żelu agarozowym i badano barwieniem bromkiem etydyny. Swoistość zweryfikowano przez hybrydyzację typu Southern blot przy użyciu wewnętrznych sond oligonukleotydowych. W celu względnego oznaczenia ilościowego wytworzonych produktów żele barwione skanowano za pomocą systemu analizy obrazu Fotodyne (Fotodyne, Hartland, Wisconsin, USA) i analizowano za pomocą oprogramowania Collage 3 (Fotodyne). Dla każdego genu docelowego względną skorygowaną wartość uzyskano przez: (intensywność. Piksel tła specyficznego dla genu amplikonu. Piksel natężenie tła). (Intensywność. Piksela dla tła amplikonu 18-S o intensywności piksela). Próbkom kontrolnym niezakażonym podano arbitralną względną skorygowaną wartość 0,01, wyznaczającą najniższy limit wykrywalności
[przypisy: opatanol cena, szkoła podstawowa w zagórzu, gimnazjum w zagórzu ]