szpitale w szczecinie pomorzany

Dwadzieścia pięć mikrolitrów tego przeciwciała połączono w 6 ml probówkach polipropylenowych z 25 ul zawiesiny mg / ml powleczonych streptawidyną kulek paramagnetycznych (Dynal Inc., Lake Success, New York, USA) rozcieńczonych w buforze ECL. Probówki wytrząsano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano 25 .l próbek lub standardowe stężenia rekombinowanej mysiej IL-18 (PeproTech Inc., Rocky Hill, New Jersey, USA). Następnie dodano dwadzieścia pięć mikrolitrów rutylowanego przeciwciała (1 .g / ml w buforze ECL) i probówki wytrząsano przez noc w temperaturze pokojowej. Reakcję zgaszono przez dodanie 200 ul / probówkę PBS i oznaczono ilościowo przy użyciu aparatu Origen 1.5 Analyzer (IGEN Inc.). Test ECL IL-18 wykrywa zarówno rekombinowaną mysią proAl-18 i dojrzałą IL-18. Zakres wykrywania wynosi od 20 pg / mL do 100 ng / mL. Stężenie 100 ng / ml proA IL-18 wykrywa się w teście jako 20 ng / ml dojrzałej IL-18. Obecność surowicy mysiej lub FBS nie przeszkadza w wykrywaniu IL-18. IFN-. i IL-1. zmierzono przy użyciu specyficznych testów ELISA (Endogen Inc.). Analiza Western blot. Śledzionę i wątroby ważono, homogenizowano w 4 objętościach lodowatego PBS zawierającego 0,2% Tween-20 i mikrotestowano przez 5 minut przy 3000 g. Następnie supernatanty zebrano do analizy Western blot. SDS-PAGE przeprowadzono na 15% żelach (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA); Na każdej linii załadowano 5. L próbek. Białka przenoszono na membrany nitrocelulozowe (Amersham International, Amersham, Wielka Brytania), stosując technikę półwytrawiania. Bufor do przenoszenia zawierał 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyny, 15% metanolu i 0,1% SDS. Po przeniesieniu niespecyficzne miejsca na błonach blokowano przez noc w temperaturze 4 ° C PBS zawierającym 5% nieskrytego mleka, 1% BSA i 0,1% Tween-20. Bloty sondowano króliczą anty-mysią surowicą odpornościową IL-18 (26), rozcieńczano 1: 400, przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie 3 razy płukano w PBS zawierającym 0,1% Tween-20. Drugie przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1: 6000, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) dodano 45 minut w temperaturze pokojowej. Blot przemywano 3 razy w PBS / Tween-20, a przeciwciało wykrywano za pomocą ECL (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts, USA). Wyniki Neutralizacja IL-18 hamuje indukcję IFN-y przez IL-12 w splenocytach mysich. Splenocyty inkubowano przez 48 godzin ze wzrastającymi stężeniami IL-12 w obecności lub nieobecności neutralizujących IgG anty-IL-18 (50 .g / ml) (13). Jak pokazano na fig. 1, zależny od stężenia wzrost IFN-y obserwowano produkcję w komórkach inkubowanych z samą IL-12. Neutralizacja IL-18 znacząco zmniejszyła IFN-y poziomy w każdym z badanych stężeń IL-12. Z drugiej strony, gdy komórki inkubowano z IL-12 w obecności niespokrewnionego IgG (anty-CSF), nie zmniejszało się IFN-y obserwowano poziomy. Hamujące działanie IgG anty-IL-18 było specyficzne dla IFN-y. W rzeczywistości, w tych samych próbkach, neutralizacja IL-18 nie wpłynęła na TNF-a indukowane IL-12p. poziomy (dane nie pokazane). Figura Wpływ neutralizacji IL-18 na indukcję IFN-y przez IL-12 in vitro. Splenocyty hodowano przez 48 godzin ze wzrastającymi stężeniami IL-12 (0,1. 10 ng / ml) w obecności lub przy braku neutralizujących IgG anty-IL-18 lub kontrolnej IgG (50. G / ml). IFN-. poziomy mierzono w supernatantach. Dane są średnie. SEM 3 myszy na grupę i są reprezentatywne dla eksperymentu na 3 wykonane. * P <0,05, ** P <0,01 względem RPMI lub kontrolnej IgG przez powtarzane pomiary ANOVA. Hamowanie aktywności ICE lub niedoboru ICE zmniejsza IFN-y indukowane IL-12p. produkcja. Splenocyty inkubowano przez 48 godzin ze wzrastającymi stężeniami IL-12 w obecności lub braku swoistego inhibitora ICE (27). [hasła pokrewne: specjalmed, szkoła podstawowa w zagórzu, nfz kielce praca ]